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快速实时笔颁搁支原体检测在制药行业中的应用

 

       支原体又称霉形体，直径在0.1-0.3&尘耻;尘，是目前发现的小的原核生物，可以轻松地通过滤膜，混入培养系统中，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分支状等多种形态。通常依附在细胞膜表面，支原体没有刚性的细胞壁，因此普通的抗生素对它根本不起作用，实验室常见的种类有：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、人型支原体、唾液支原体、肺支原体和梨支原体等。

       生物制药产物（也被称为生物制品或大分子药物）的支原体污染是由生产过程中的细胞培养污染引起的，会给患者带来潜在的健康风险。支原体几乎能够影响细胞培养的每一个参数，并且通常仅产生微小的可见变化，对于制药产业来说，它们是一种无法掌控的、可造成潜在损害的因素。因此，监管部门要求制造商检测自己生产的生物制品，确保被放行出厂的产物中都不含支原体。

      生物制药产物（也被称为生物制品）是生产和提取自细菌、酵母、哺乳动物细胞系或哺乳动物等生物来源的医药产物。疫苗、血液成分、重组蛋白、基因治疗、组织以及用于治疗的细胞都属于这个类别。它们含有核酸、蛋白、糖以及由这些物质构成的复合物，与人体内天然存在的分子*相同或者具有相似性。与化学合成药物（通常指的是小分子）不同，生物制品的分子量要大得多，通常是小分子药物的 100 倍以上。用哺乳动物细胞系进行生物制药生产通常使用基因工程技术开发出表达生物大分子的真核细胞系（如CHO 或HEK293），然后进行收获、纯化和制剂。

       由于生产流程十分复杂，所以生物制药产物的生产和产物放行都面临着*的挑战。首先，细胞系可能会被支原体污染，因此批放行之前需要先进行支原体检测。其次，由于生物制品采用过滤法除菌，所以存在支原体或病毒穿过滤膜的潜在风险。第三，污染物可能会通过原料进入细胞培养物。正因为如此，支原体检测尤其是早期报警系统（也称为过程控制）是十分必要的质量控制技术，以期尽快尽早地发现污染物。

      在生物制药行业，支原体污染产生的影响几乎具有毁灭性，例如整批产物都必须丢弃，生产车间也必须停产整顿 14。国际监管机构发布的指南已经阐明，为了确保产物的安全性、纯度和产物效力，生物制药产物中不能存在支原体污染。因此，为了确保整个生产流程的平稳，必须尽早实施支原体检测。

     支原体检测方法有两种经典的方法被用于常规支原体检测，它们的灵敏度和可靠性已经获得了证实：（i）培养法（也被称为琼脂肉汤法），（ii）指示细胞培养法。有些基于酶或免疫学的非药典分析法具有速度快和容易实施的优点，但它们的灵敏度都不如培养法。因此，药典专论认为这些检测方法不能替代常规检测。在过去几年里，对速度快、灵敏度高且稳健性高的支原体检测法的需求迫切性日益增加，因为经典培养法的所需时间过长，可能会耽搁产物的放行，并由此产生高昂的费用。EP 指南指出，如果 PCR 检测方案的灵敏度能达到与经典培养法相同的水平，并且具有良好的稳健性和特异性，则可以用 PCR作为支原体检测方案替代经典培养法。

     实时 PCR（qPCR）能够实时报告 DNA 的扩增情况。因此，实时 PCR 不需要在 PCR 处理后用凝胶电泳等方法检测 DNA，大幅降低了在实验室里发生污染的风险，并且有助于对终结果进行解释。实时 PCR 使用的探针含有与短 DNA 序列（18 - 30 个碱基对）相连接的荧光染料。这种探针在 PCR 的每个扩增循环中都会被纳入新合成的 DNA 互补链。市场上有多种不同的探针设计可供选择，其中常见的探针之一就是 MycoTOOL qPCR 使用的水解探针。在每个 PCR 循环结束后，这种探针都会以荧光强度的形式报告 DNA 的总量。随着目标序列的不断扩增，荧光信号的强度也会成比例地升高。将荧光强度与 PCR 循环数对应作图，就可以得到一条典型的 S状 qPCR 曲线。

    虽然很多国家的药典都将 PCR描述为一种有效的支原体检测方法，但各国为这种方法制定的方案或验证要求却极少具有一致性。EP 和 JP 等药典详细描述了有关这种方法的验证指南，但其他国家仅仅只是指出 PCR 是一种经过验证的有效检测方法。不过，所有国家都要求对这种检测法进行适当的验证，并与常规支原体检测法进行比较。

   赛多利斯快速实时 PCR 支原体检测试剂盒超高灵敏度：起始体积 200μl-18mL, 保证了实验高的灵敏度 ? 超高特异性：精选 TaqMan® 探针对 110 种支原体的 16S rRNA 基因具有 高度特异性，多个独立的实验室均证 明了这款试剂盒的优异性能 ? 超短检测时间：采用 qPCR 循环对 样本 DNA 进行扩增，通过软件系统 得到实验结果。使检测时间从几周缩 短至 3 小时 ? 超低检测线：检测线可达 10CFU/ mL ? 超高安全性：Microsart® 支原体验证 标准品不具有感染性，确保操作者使的特点。并通过EP 验证。